研究了各种冷冻液体制剂的玻璃化和冷冻保存对鸡胚泡的影响。胚泡的分离和纯化后的新鲜，冷冻保护剂不同DMSO（二甲基亚砜），EG（乙二醇）和蔗糖加入到DMEM以形成6个玻璃化冷冻保护剂在超低温冷冻。苏后通过台盼蓝染色测定活细胞活力。果：在冷冻保存玻璃化，胚泡具有最高的存活率在式2（10％EG 10％DMSO 0.5 mol / L蔗糖 20％FBS DMEM）的玻璃化复苏后（71.32％）。苏和玻璃化式1和3后的存活率之间的差异显著（P <0.05）和复苏和条件式4，5的玻璃化后的存活率之间的差异，6极显著。（P <0.01），可用作鸡胚细胞的玻璃化液。;囊胚;玻璃化细胞分类号：S831.4 9文献编码：A文章编号：1007-273X（2009）11-0007-03随着冷冻保存技术的发展，许多哺乳动物遗传细胞（精子，卵子一些濒危动物的胚胎和胚胎在极低的温度下达到了低温保存。来越广泛[1]。实验采用冷冻冷冻X期鸡胚囊细胞，研究了该方法对鸡胚复苏的影响，并对家禽遗传物资源保护进行了基础研究。
经实现了。料与方法实验期和地点实验期：2009年2月至2009年4月。验地点：湖南省兽医研究与动物育种研究所生物技术研究室。
料和鸡蛋来自由湖南兽医研究所生物技术研究室提出的白莱坑鸡。要反应物的DMEM（高糖，Gibco）中，FBS，DMSO（二甲亚砜，Sigma）的PVP（聚乙烯基吡咯烷酮，Sigma公司），EG（乙二醇，Sigma公司））（胎牛血清，由杭州四季青Co.，Ltd生产）蔗糖（蔗糖，Sigma）。法鸡胚囊细胞采集[2]在无菌环境中，将灭菌后的卵置于培养皿中，使胚盘的位置直接位于上方。割和刮蛋清浓缩物在打磨板，轻轻与纸环灭菌过滤器固定胚泡和滤纸的环与胚泡转移到含有PBS的培养皿中。用发圈去除蛋黄，切开周围的黑暗区域并保持中心区域有光泽，然后用0.5％PBS洗涤两次并放在一边。玻璃化溶液和复苏胚泡玻璃为了制备冷冻保存溶液和复苏的方法的准备，是指该液体制剂的方法汉威等冷冻并且复兴PGC细胞[3]。速冷冻胚泡溶液包含细胞悬浮液I和细胞悬浮液II。胞悬浮液I：DMEM 20％FBS;细胞悬液II：不含血清 冷冻保护剂的DMEM（在不同制剂中，EG，DMSO和蔗糖的比例不同）。同玻璃化液体的制剂示于表1中。冻方法用PBS洗涤的囊胚细胞悬浮在细胞悬液I中，使用软管和等体积缓慢加入细胞悬浮液II以使混合物标准化。细胞密度调节至2-3×10 7个细胞/ ml并开始管。用0.25ml精子吸管按顺序注入0.5mol / L（5cm）的蔗糖溶液，首先选择细胞悬浮液作为2然后抽吸5至3.0厘米，然后吸入1.5至2.0厘米的空气柱。后，将玻璃化胚胎冷冻溶液吸入1.5和2.0cm之间，并将胚胎尽可能地置于溶液的中心。入1.5至2.0厘米的空气柱。后，将细胞悬浮液II吸出至冷冻吸管的末端，并通过电加热钳子关闭吸管。后将其浸入液氮中进行冷冻保存。入到1.5ml微量离心管中加入0.2ml FBS加入1ml无血清DMEM的溶液缓慢加入到该管的底部，以获得解冻溶液：用于制备复苏液复苏的方法。察到明显的分层，并且在使用前在37-38℃下进行预热。胚泡细胞复苏时，将冷冻的秸秆从液氮罐中取出并迅速置于37-38℃的水浴中10秒钟，用剪刀剪切秸秆的末端无菌并用注射器缓慢充气。液体的上层，当细胞降至DMEM和FBS液位限制时，通过以1000rpm离心5分钟收集胚泡细胞沉淀，并且胚泡细胞沉淀是悬浮在细胞培养基中。
胞活力将悬浮在培养基中的胚泡以2至3×10 4个细胞/孔的细胞密度转移至6孔培养板。CO 2培养箱中于37℃，5％CO 2和饱和湿度下孵育2小时后，计数死细胞数和活的未染色细胞数，并在细胞染色后计数细胞活力。盼蓝胚泡。
同时冷冻的鸡胚泡细胞作为对照。态学鉴定使用倒置显微镜观察培养4小时后胚泡的生长，集落形成和集落的外部特征。据处理实验的结果由SAS V8.01统计分析软件处理，测试方法是X2测试。不同的玻璃化液体冷冻细胞活力和台盼蓝染色的结果和分析。苏后囊胚的存活率在表2中给出。表2所示，玻璃化和复苏vitullaires细胞存活率后在冷冻保护剂冷冻保护1的条件和3分别为65分别为65％和61.75％，差异有显着性（P <0.05）。冻保护剂条件下的存活率为71.32％并且具有冷冻保护作用。体1和冷冻保护剂3的活性之间的差异非常显着（p <0.01）。发现的是，胚泡的恢复，在冷冻保护剂4，5和冷冻保护剂的冷冻保护6个生存率的条件后分别为：35.73％，36.78％和30.31％，分别相比，前三个保护的解决方案（1，2和3），所不同的是高度显著（p 0.05），而冷冻保护剂6与冷冻保护剂4和5显着不同（p <0.05）。苏后，使用台盼蓝染色计数胚泡（参见图1）。态学观察复苏后，用保护性玻璃接种胚泡细胞，6小时后，观察到一些细胞粘附。时，表现出粘附特性的胚泡细胞开始彼此融合。璃化和复苏后的胚泡细胞仍然培养8小时（参见图2）。于保存家禽遗传物质的讨论集中在：生活保护。子冷冻保存。DNA的保存（cDNA文库，核苷酸序列数据库等）。胎被冷冻保存。中，活泼的保护形式是保护家禽的遗传物质的最可靠的方法，但它是由因素如资金，冷凝器价格近交衰退和地方病的限制;精子冷冻保存作为从遗传物质中保存细胞的有效手段，只能得到保护。年男性家禽和精子受精率的基因组中是复苏后降低（50％至70％），存储在DNA形式的遗传物质是仅由特定的基因或基因组的一小部分整个，家禽的受精卵很大，结构很好。的成分复杂，抗冻性低，含有大量蛋黄，使冷冻保存变得困难。于禽类的生殖系统中，当蛋在体外产生的特殊性，鸡胚已经是基团在与内和外胚层胚泡期的细胞（即的d。阶段X胚泡）。1996年，Pain等人。次系统地描述了X期胚泡含有潜在的禽胚胎干细胞，而用于转基因操作的PGC（原代生殖细胞）细胞来自阶段胚泡的中央带状细胞群。X.X期细胞可用作外源基因载体，在制备壳聚糖和转基因动物的生产中具有良好的应用前景。此，使用玻璃化和冷冻的技术来研究在家禽胚泡阶段X的冷冻保存是家禽遗传资源保存的另一个可靠的手段，以及细胞在遗传操作的源极体外胚泡。璃化的基本原理是将其中，凝固和脱水后，被直接转换成液氮中并迅速形成玻璃态避免胞内和胞外的损伤细胞的冷冻过程中添加冷冻保护剂的浓度高。持低温。然玻璃化冷冻保存已经开始在超低温保存技术和低温生物学研究较晚，但已经吸引了由于其良好的冷冻效果，其发展前景备受关注。该研究中，通过在封闭的小麦管中玻璃化冷冻保存鸡胚，并且如在常规的慢速冷冻方法中那样完全分离胚胎和液氮。胚玻璃玻璃化的最低回收率可达57.73％，最高回收率达70.32％，证明制冷剂配方可行。
而，韩伟等人研究了PGCs的玻璃化和冷冻保存率。[3]略低，原因如下：冷冻程序的影响。果该小区是在玻璃化液中，如果平衡时间过短，所述冷冻剂的渗透将不足，冷凝器价格从而导致细胞脱水不足以形成内源性的冰晶体。果时间太长，高浓度的冷冻保护剂将对细胞有毒。哺乳动物胚胎和卵母细胞的玻璃化冷冻过程中[4~8]，冷冻物质通常置于室温下浓度增加的玻璃化液体的稀溶液中，以获得固化和脱水。免损坏高浓度的冷冻液体。此，在这项研究中，玻璃化冷冻过程中的平衡过程得到改善：在待冷冻的鸡胚细胞的悬浮处理期间，细胞悬浮液I和细胞悬浮液II是分阶段加入并混合形成玻璃化液体的最终浓度。个过程是一个过程，其中胚泡细胞最终逐渐增加所述冷冻剂的浓度，并达到在冷冻液中的最终浓度玻璃化，以确保制冷剂DMSO和EG可以充分渗入细胞，由于较低的温度，DMSO，EG对细胞的毒性也较小。然冷冻保护剂是指用于制备玻璃化液到鸟类细胞如汉威的方法，该冷冻过程难以控制的接触时间以及在与剂量胚泡细胞冷冻保护接触填充管的过程。时，管冷却后液氮的快速供应和“冲击”情况对冷冻效果有一定影响。
冻液的毒性和形成玻璃化的能力的影响。性和液体的玻璃化的密封能力涉及其组成和concentration.Lors该试验中，该渗透防冻剂DMSO，EG，单独使用或与非渗透性冷冻保护剂的蔗糖相结合，被用于制造液体玻璃化。据试验结果，玻璃化2（10％DMSO 10％EG 0.5 mol / L蔗糖）具有最佳保护作用，表明DMSO，EG和蔗糖均为有效的冷冻保护剂，用于胚泡细胞的玻璃化。
3，4和6相比，冷冻溶液1显着不同（P <0.05）或极显着（P <0.01），表明EG对玻璃化的影响显着更大。泡为DMSO，高浓度DMSO。（20％）对胚泡细胞有毒。冻液体和2 1和3之间的差异是高度显著，表明DMSO和EG（10％ 10％）的组合在PGC鸡细胞的玻璃化起到防冻剂的渗透浓度下的作用。补作用降低了玻璃化液中DMSO的浓度，降低了对细胞的毒性作用，提高了玻璃化能力。时，冷冻液体1，2，3，4，5和6进行了比较，结果发现该渗透cryoprotecteur的低浓度并不能充分地保护囊胚细胞玻璃化，大概是因为能力当浓度低时，玻璃化减少。暖过程的影响。冷冻保存的玻璃化法如胚胎和卵母细胞[4-8]中，温热冷冻材料被顺序地传送到解冻溶液的浓度降低的方法，以稀释和洗涤以去除冷冻保护剂的高浓度。该实验中，升温后的胚泡的细胞被慢慢地从解冻液体顶部层注入，并在DMEM和FBS.Ce过程之间的界面被压是洗涤的在系列稀释的方法，其可以去除冷冻保护剂，避免细胞内外。透压的突然变化和界面下层的FBS促进复苏后细胞形态和PGC功能的恢复[9]，这对细胞复苏有一定的促进作用。
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